Bei der konfokalen Mikroskopie wird jeweils nur ein beugungsbegrenzter Lichtfleck eines Präparates beleuchtet.
Mit diesem Lichtfleck wird die zu untersuchende Probe Punkt für Punkt abgerastert. Das reflektierte Licht wird mit einem Photonenzähler aufgefangen, sodass eine anschließende Rekonstruktion des Bildes möglich ist.
Aufgrund der hohen axialen Auflösung der konfokalen Mikroskope können Schichtaufnahmen angefertigt werden, die eine 3D Rekonstruktion des Objektes ermöglichen.